1　范圍

本方法規(guī)定了飲料、茶葉及相關(guān)制品中二氟尼柳等18種抗風(fēng)濕類化合物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。

本方法適用于飲料、茶葉及相關(guān)制品中二氟尼柳等18種抗風(fēng)濕類化合物的測定，其他基質(zhì)可參照本方法定性檢測。

2　原理

試樣經(jīng)甲醇水溶液提取，稀釋后采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，外標(biāo)法定量。

3　試劑和材料

除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水。

3.1　試劑

3.1.1　乙腈（CH₃CN）：色譜純。

3.1.2　甲醇（CH₃OH）：色譜純。

3.1.3　甲酸（HCOOH）：色譜純。

3.1.4　乙酸銨（CH₃COONH₄）：優(yōu)級(jí)純或相當(dāng)者。

3.2　溶液配制

3.2.1　含0.05 %甲酸的2 mmol/L乙酸銨溶液：稱取0.154 g乙酸銨（3.1.4），加入適量水溶解, 再加入0.5 mL甲酸（3.1.3），用水定容至1000mL。

3.2.2　甲醇水溶液（4+1）：準(zhǔn)確量取400 mL甲醇（3.1.2）和100 mL水，混勻后備用。

3.3　標(biāo)準(zhǔn)品

二氟尼柳、美洛昔康、舒林酸、吡羅昔康、醋氯芬酸、貝諾酯、依托考昔、萘普生、芬布芬、奧沙普秦、尼美舒利、氟比洛芬、雙氯芬酸鈉、依托度酸、吲哚美辛、萘丁美酮、非普拉宗、塞來昔布標(biāo)準(zhǔn)品的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量詳見附錄A中的表A.1，各標(biāo)準(zhǔn)品純度均≥95%。

3.4　標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

3.4.1　標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(500 μg/mL)：準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品（3.3）50.0 mg（精確至0.0001 g），分別置于100 mL容量瓶中，美洛昔康加5mL水溶解，再用甲醇（3.1.2）稀釋至刻度，其余標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度各為500 μg /mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20℃保存，有效期3個(gè)月。

3.4.2　混合標(biāo)準(zhǔn)中間液A（1 μg/mL）：分別準(zhǔn)確吸取0.2 mL美洛昔康、舒林酸、吡羅昔康、貝諾酯、依托考昔、奧沙普秦、雙氯芬酸鈉、依托度酸、非普拉宗各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（3.4.1），置于同一100 mL容量瓶中，用甲醇（3.1.2）稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液A，-20℃保存，有效期1個(gè)月。

3.4.3　混合標(biāo)準(zhǔn)中間液B（5 μg/mL）：分別準(zhǔn)確吸取1.0 mL二氟尼柳、醋氯芬酸、萘普生、芬布芬、尼美舒利、氟比洛芬、吲哚美辛、萘丁美酮、塞來昔布各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（3.4.1），置于同一100 mL容量瓶中，用甲醇（3.1.2）稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為5 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液B，-20 ℃保存，有效期1個(gè)月。

3.4.4　混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液A和B適量，置于同一容量瓶中，用甲醇（3.1.2）稀釋配制成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液S1~S5?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)中間液A（3.4.2）中各化合物濃度為2ng/mL、4ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL；混合標(biāo)準(zhǔn)中間液B（3.4.3）中各化合物濃度為10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200ng/mL；臨用新制或依儀器響應(yīng)情況配制適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

3.5　微孔濾膜：0.22 μm，有機(jī)相。

4　儀器和設(shè)備

4.1　高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI源）。

4.2　粉碎機(jī)。

4.3　電子天平：感量分別為0.0001 g和0.01 g。

4.4　超聲波水浴。

5　試樣制備

5.1　飲料

充分混勻，直接取用。

5.2　茶葉及相關(guān)制品

取適量有代表性的試樣，粉碎機(jī)粉碎后過40目篩，裝入潔凈容器中，密封并標(biāo)記。

6　分析步驟

6.1　樣品提取

6.1.1　飲料

準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣置于50 mL容量瓶中，加入20 mL甲醇-水溶液（4+1）（3.2.2），搖勻（固體飲料需充分溶解），再用甲醇-水溶液（4+1）（3.2.2）定容至刻度，混勻，經(jīng) 0.22 μm濾膜過濾，取濾液，根據(jù)實(shí)際濃度適當(dāng)?shù)南♂屩凉ぷ髑€線性范圍內(nèi)，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

6.1.2　茶葉及相關(guān)制品

準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣置于25 mL容量瓶中，加入20 mL甲醇-水溶液（4+1）（3.2.2），搖勻，超聲30 min，冷卻至室溫后，用甲醇-水溶液（4+1）（3.2.2）定容至刻度，混勻靜置10 min，準(zhǔn)確吸取2 mL上清液至10 mL容量瓶中，用甲醇-水溶液（4+1）（3.2.2）定容至刻度，混勻，經(jīng) 0.22 μm濾膜過濾，取濾液，根據(jù)實(shí)際濃度適當(dāng)?shù)南♂屩凉ぷ髑€線性范圍內(nèi)，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

6.2　測定

6.2.1　儀器參考條件

6.2.1.1　液相色譜條件

a) 色譜柱：C₁₈柱，100 mm× 2.1 mm，粒徑 2.2 μm，或性能相當(dāng)者。

b) 流動(dòng)相：A為乙腈（3.1.1），B為含0.05 %甲酸的2 mmol/L乙酸銨溶液（3.2.1），梯度洗脫程序見表1。

c) 流速：0.3 mL/min。

d) 柱溫：35 ℃。

e) 進(jìn)樣量：2 μL。

表1 梯度洗脫程序

6.2.1.2　質(zhì)譜條件

a) 離子源：電噴霧離子源（ESI源）。

b) 檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。

c) 掃描方式：正離子模式和負(fù)離子模式。

d) 氣簾氣（CUR）、霧化氣（GS1）、輔助氣（GS2）、碰撞氣（CAD）均為高純氮?dú)饣蚱渌线m氣體，使用前應(yīng)調(diào)節(jié)相應(yīng)參數(shù)使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測要求，電噴霧電壓（IS）、去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）等參數(shù)使用前應(yīng)優(yōu)化至最佳靈敏度，監(jiān)測離子對(duì)和定量離子對(duì)等信息詳見附錄B。

6.2.2　定性測定

按照上述條件測定試樣和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，如果試樣中的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與混合標(biāo)準(zhǔn)工作液中的某種組分一致（變化范圍在±2.5%之內(nèi)）；試樣中定性離子對(duì)的相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)?shù)幕旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作液的相對(duì)豐度一致，相對(duì)豐度（k）偏差不超過表2規(guī)定的范圍，則可判定為試樣中存在該組分。

表2 定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差

6.2.3　定量測定

將混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液（3.4.4）按儀器參考條件（6.2.1）進(jìn)行測定。以混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。若試樣檢出與混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液一致的化合物，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算得到其含量。

二氟尼柳等18種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖見附錄 C。

7　結(jié)果計(jì)算

結(jié)果按式（1）計(jì)算：

                           …………………………………………（1）

式中：

X — 試樣中各待測物的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；

c — 從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中讀出的供試品溶液中各待測組分的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；

V — 試樣溶液最終定容體積，單位為毫升（mL）；

m — 稱樣量，單位為克（g）；

K — 試樣制備過程中的稀釋倍數(shù)。

計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

8　檢測方法的靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度

8.1　靈敏度

當(dāng)飲料稱樣量為1 g，定容體積為50 mL，本方法中各化合物的定量限如下：

美洛昔康、舒林酸、吡羅昔康、貝諾酯、依托考昔、奧沙普秦、雙氯芬酸鈉、依托度酸、非普拉宗定量限為0.2 mg/kg；二氟尼柳、醋氯芬酸、萘普生、芬布芬、尼美舒利、氟比洛芬、吲哚美辛、萘丁美酮、塞來昔布定量限為1.0 mg/kg。

當(dāng)茶葉及相關(guān)制品稱樣量為1 g，定容體積為125 mL，本方法中各化合物的定量限如下：

美洛昔康、舒林酸、吡羅昔康、貝諾酯、依托考昔、奧沙普秦、雙氯芬酸鈉、依托度酸、非普拉宗定量限為0.5 mg/kg；二氟尼柳、醋氯芬酸、萘普生、芬布芬、尼美舒利、氟比洛芬、吲哚美辛、萘丁美酮、塞來昔布定量限為2.5 mg/kg。

8.2　準(zhǔn)確度

本方法在0.2~25 mg/kg添加濃度范圍內(nèi)，回收率為71%~116%。

8.3　精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的15 %。

附錄A

二氟尼柳等18種化合物相關(guān)信息

表A.1  18種化合物的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量

A

A         

附錄B

參考質(zhì)譜條件

a)         離子源：電噴霧離子源（ESI源）；

b)        檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；

c)         掃描方式：正離子模式和負(fù)離子模式；

d)        電噴霧電壓（IS）：5500 V（ES+）；-4500 V（ESI-）；

e)         氣簾氣（CUR）：35 psi；

f)         霧化器（GS1）：55 psi；

g)        輔助氣（GS2）：55 psi；

h)        離子源溫度（TEM）：500 ℃。

表B.1 二氟尼柳等18種化合物定性、定量離子和質(zhì)譜分析參數(shù)

^*定量離子對(duì)。

注：（1）方法提供的監(jiān)測離子對(duì)等測定條件為推薦條件，各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)所配置儀器的具體情況作出適當(dāng)調(diào)整；在樣品基質(zhì)有測定干擾的情況下，可選用其他監(jiān)測離子對(duì)。

（2）為提高檢測靈敏度，可根據(jù)保留時(shí)間分段監(jiān)測各化合物。

附錄C

二氟尼柳等18種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖

圖C.2  18種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提取離子色譜圖

本方法負(fù)責(zé)起草單位：湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院。

驗(yàn)證單位：大連市食品檢驗(yàn)所、四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院、遼寧省食品檢驗(yàn)檢測院、湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院、重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院。

主要起草人：張莉、江豐、黎星、劉迪、余婷婷、唐昌云